细胞冻存与计数.ppt

《细胞冻存与计数.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞冻存与计数.ppt（15页珍藏版）》请在一课资料网上搜索。

1、第五章细胞冻存与细胞计数 一 非玻璃化冻存冻存方法举例 肿瘤细胞 1 主要材料 1 仪器设备 普通冰箱 20 低温冰箱和 70 80 超低温冰箱 液氮冻存罐 离心机等 2 冻存管 容量为1ml或1 5ml 3 冷冻保护液 FBS DMSO 培养基 4 1 5现配现用 或配制后放入普通冰箱冰盒内冷冻保存 使用前 于室温下水浴融解 4 待冻存细胞 肿瘤细胞 2 冻存过程 1 待冻存细胞悬液的准备 按常规方法消化处于对数生长期的细胞培养物 将细胞悬液以800 1000r min离心5min 弃上清液 向沉淀物中加入培养基 轻轻吹吸均匀 制备成单细胞悬液 计算细胞总数 将细胞悬液与冻存液按1 1混合

2、使细胞密度达1 106 1 107个 ml 按每管1ml的量 分装于冻存小管内 拧紧管盖 在冻存小管上做标记 包括细胞代号及冻存日期 2 分级冷冻 有几种方法可以使用 先将冻存小管放人普通冰箱冷藏层 4 8 约40min 接着置于普通冰箱冷冻层 10 20 30 60min 再于 30 放置30min左右 可省略 然后在 70 80 下过夜 最后将冻存小管投入液氮保存 还有一种简单的方法 就是将冻存小管先悬挂在液氮罐口20min 再直接投入液氮中保存 第三种方法是 用4 预冷的冷冻保护液悬浮细胞 分装冻存小管后 将冻存小管放在4 下30min 然后置于壁厚1cm以上的泡沫塑料小盒内封好 立刻将

3、小盒放置在 70 80 冰箱中24h以上至1周 再将冻存小管投入液氮中保存 3 记录 做好冻存记录 记录内容包括冻存日期 细胞代号 冻存管数 冻存过程中降温的情况 冻存位置以及冻存经手人 3 冻存结果如此冻存的细胞 其存活率可达90 以上 盒夹层内装入100 异丙醇 程序降温盒放到 80度的冰箱里 盒内温度就会成线性下降 可实现每分钟1 的降温 可大大的提高细胞的存活率 程序降温盒 注意事项 在使用DMSO前 不需要对其进行高压灭菌 因其本身就有灭菌作用 在常温下 DMSO对人体有毒 故在配制冷冻保护剂时最好带手套 冻存管投入液氮时 动作要小心 轻巧 以避免液氮从液氮罐内溅出 应注意控制冻存细

4、胞的质量 勿将冻存的细胞放置在0 60 这一温度范围内过长时间 低温损伤主要发生在这一温度范围内 二 细胞计数 用细胞计数法测定细胞生长动力学是目前采用的最普遍的方法 血细胞计数板人工计数细胞计数器血细胞计数板 常用的是改良的纽巴氏 Neubauer 血细胞计数板 具体操作程序如下 1 取血细胞计数板和盖玻片 用75 酒精擦净 将盖玻片放于计数板上 2 用滴管取混合均匀的细胞悬液 滴入计数室内 要保证盖片下充满悬液 注意盖片下不要有气泡 也不能让悬液流入旁边槽中 滴加细胞悬液后约静置1分钟后则可以进行计数 3 统计四个大格的细胞数 将血球计数板放于显微镜的低倍镜下观察 并移动计数板 分别数出四

5、角的四个大格 每个大格含有16个中格 中的细胞数 对压边线细胞 计上不计下 计左不计右 计算 一般以每毫升含细胞数来表示 大方格的面积为1mm2 室深为0 1mm 则体积为0 1mm3 推算得0 1mm3 104 才为1ml体积 所以计算公式为 细胞悬液的细胞数 ml 四个大格子细胞数 4 104 稀释倍数计数中 如果细胞悬液的细胞浓度过高 必须稀释后再计 如果细胞数太少 可离心浓缩后再计 每个细胞悬液至少滴样两次求平均值 用细胞计数板计数时应注意的事项 1 不要漏计 不要重复 2 细胞悬液应混合均匀 3 浓度不可过高也不可过低 四 活细胞的染料排除检测法 原理 由于死细胞的细胞膜通透性发生改

6、变 某些染料可大量进入却不被排出 因而细胞呈色 而活细胞反之 能排出进入细胞内的染料 因而不易着色 此法的原理即是利用死 活细胞对染料的不同反应而区分开两种细胞 最常用的为 台盼蓝排除检测法 1 0 4 台盼蓝溶液的配制 称取4g台盼蓝 加少量蒸馏水研磨 加双蒸水至100ml 用滤纸过滤 40C保存 使用时 用PBS稀释至0 4 即成工作液 2 活体染色与细胞计数 将1滴细胞悬液 贴壁细胞可经0 25 胰蛋白酶溶液消化后 吹打制成细胞悬液 与2滴台盼蓝液混合后 滴入细胞计数板 2min后 在显微镜下计数至少200个细胞 未着色的为活细胞 呈蓝色的为死细胞 计算活细胞百分比 注意事项 台盼蓝染细胞时 时间不宜过长 否则 部分活细胞也会着色 会干扰实验结果